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芍药受体再生系统的建立

学术期刊发表网 位置:农业论文 时间:2022-04-14 09:00 (12)

摘要:摘 要:分别以子叶和愈伤组织为外植体建立芍药受体系统。结果表明,以子叶为受体时,芍药的最佳选择抗生素为潮霉素,最适选择压为 8mg/L,最佳抑菌剂为头孢霉素,当头孢霉素为 50mg/L 时

  摘 要:分别以子叶和愈伤组织为外植体建立芍药受体系统。结果表明,以子叶为受体时,芍药的最佳选择抗生素为潮霉素,最适选择压为 8mg/L,最佳抑菌剂为头孢霉素,当头孢霉素为 50mg/L 时,农杆菌生长可完全受到抑制;以愈伤组织为受体时,芍药的最佳选择抗生素为潮霉素,最适选择压为 6mg/L,最佳抑菌剂为头孢霉素,当头孢霉素为 100mg/L 时,农杆菌生长可完全受到抑制。通过芍药受体再生系统的建立,为芍药遗传转化、基因克隆等技术的应用提供大量快速繁殖材料。

  关键词:芍药;愈伤组织;受体系统;再生

  植物遗传转化是应用 重组 DNA 技术、细胞组织培养技术或种质系统转化技 术,有目的地将外源基因或 DNA 片段插入到受体植物 基因组中,并使其在后代植株中得以表达的过程[1]。植 物遗传转化可以定向改变植物遗传信息,改善育种进 程,提高植物抗性,获得性状良好的转基因植物。建立 高效的再生受体系统是基因遗传转化的基础,基因转 化需要有大量且质量优良的受体来接受外源基因的整 合,通过鉴定有更多的受体实现基因的表达,从而筛选 出转基因再生植株。目前,由于芍药间接途径诱导不 定芽困难,增殖较慢,直接途径诱导不定芽数量少,不 易再生,阻碍了芍药在分子生物学上转基因研究的发 展,因此为芍药建立高效、稳定的受体系统迫在眉睫。

  1 材料与方法

  1.1 实验材料

  外植体:愈伤组织、芍药试管苗的子叶;抗生素:潮 霉素、庆大霉素、头孢霉素、 羧苄霉素。

  1.2 选择抗生素的确定

  将芍药试管苗的子叶接种于培养基 MS+6-BA 1.0mg/L+GA3 0.5mg/L。将芍药愈伤组织分成大小均匀 小块,接种于培养基 MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 2.0mg/L。 在以上 2 种培养基中,分别添加不同浓度庆大霉素、潮 霉素,观察子叶不定芽生长情况和愈伤组织分化、褐化 情况,确定遗传转化选择压和最佳转化受体。

  1.3 抑菌抗生素的确定

  将芍药试管苗的子叶接种于培养基 MS+6-BA 1.0mg/L+GA3 0.5mg/L。将芍药愈伤组织分割成大小均 匀的小块,接种于培养基 MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 2.0mg/L。在以上 2 种培养基中,分别添加不同浓度头孢霉素、羧苄霉素,观察子 叶不定芽生长情况和愈伤组织块分化、褐化情况,确定 遗传转化选择压和最佳的转化受体。各种抗生素浓度 见表 1。

抗生素

  1.4 数据统计

  不定芽分化率(%)= 分化的外植体 / 接种的外植 体总数×100。

  2 结果与分析

  2.1 子叶对抗生素种类和浓度的筛选

  由表 2 可知,在添加不同种类和浓度的选择抗生 素培养基中,子叶分化不定芽的效率不同。试验发现, 在添加潮霉素培养基中,不定芽生长较慢,随着浓度的 增大,子叶对潮霉素的敏感度不断增大,分化率逐渐下 降。结果表明,当潮霉素浓度为 2 mg/L 时,分化率最大 为 75.57%,但与空白对照相比,下降了 11.33 百分点。 当潮霉素浓度为 8mg/L 时,分化率较低,为 2.67%;当 潮霉素浓度为 10mg/L,分化率为 0,且子叶生长势较 弱,出现萎蔫甚至死亡。所以,当潮霉素浓度为 8mg/L 时,可作为芍药遗传转化的选择压。当在培养基中加 入庆大霉素时,不定芽在 5mg/L 时分化只有 7.76%,当 浓度为 10mg/L 时,分化率为 0,说明子叶对庆大霉素 的敏感度过高,因此庆大霉素不适宜作为选择抗生素。

  由表 3 可知,在添加不同种类和浓度的抑菌抗生 素培养基中,子叶分化不定芽效率均受到一定程度的 抑制。试验发现,在添加头孢霉素培养基中,不定芽生 长虽受到抑制,但是抗敏感度较高,当浓度为 50mg/L, 分化率为 71.1%,当浓度达到 150mg/L,依然有 16.67%子叶可以分化不定芽。而在加入羧苄霉素的培养基中, 当浓度为 50mg/L 时,分化率就已经降低到 38.9%,所 以羧苄霉素不适宜作为抑菌抗生素,可选择头孢霉素 50mg/L 作为芍药遗传转化过程中的抑菌剂。

叶子叶子

  2.2 愈伤组织对抗生素种类和浓度的筛选

  由表 4 可知,在添加不同种类和浓度的选择抗生 素培养基中,愈伤组织分化不定芽的效率不同。试验发 现,在添加潮霉素培养基中,不定芽生长较慢,随着浓 度的增大,子叶对潮霉素的敏感度不断增大,分化率逐 渐下降,褐化甚至死亡。结果表明,当潮霉素浓度为 2mg/L 时,分化率最大为 68.9%,但与空白对照相比,下 降了 15.53%。当潮霉素浓度为 6mg/L 时,分化率较低, 为 6.67%;当潮霉素浓度为 8mg/L,分化率为 0,且愈伤 组织生长势较弱,褐化现象严重甚至死亡。所以,当潮 霉素浓度为 6mg/L 时,可作为芍药愈伤组织遗传转化 的选择压。当在培养基中加入 10mg/L 庆大霉素时,不 定芽分化只有 5.57%;当浓度为 15mg/L 时,分化率为 0,说明愈伤组织对庆大霉素的敏感度过高,所以庆大 霉素不适宜作为选择抗生素。

  由表 5 可知,在添加不同种类和浓度的抑菌抗生 素培养基中,愈伤组织分化不定芽效率均受到一定程 度的抑制。试验发现,在添加头孢霉素培养基中,不定 芽生长虽受到抑制,但是抗敏感度较高,当浓度为 100mg/L,分化率为 71.1%,当浓度达到 200mg/L,依然 有 23.33%愈伤组织可以分化不定芽。而在加入羧苄霉 素的培养基中,当浓度为 100mg/L 时,分化率就已经降 低到 6.67%,所以羧苄霉素不适宜作为抑菌抗生素,可 选择头孢霉素 100mg/L 作为芍药遗传转化过程中的抑 菌剂。

组织抗生素

  3 结论与讨论

  试验结果表明:子叶和愈伤组织对抗生素均较为 敏感,都可作为良好的受体。当以子叶为受体时,潮霉 素的抗性质量浓度为 8mg/L;头孢霉素为 50mg/L 时, 农杆菌生长可完全受到抑制。以愈伤组织为受体时,潮 霉素的抗性质量浓度为 6mg/L,头孢霉素为 100mg/L 时,农杆菌生长可完全受到抑制。

  3.1 抗生素筛选对遗传转化的影响

  农杆菌介导法是最有效的植物基因遗传转化的方 法之一,因其价格低廉、操作简便、可导入的目的基因 片段大、拷贝数低、不易发生重排、符合孟德尔遗传定 律等优点,所以植物可通过农杆菌介导法获得大量的 转基因植物[2]。在农杆菌介导的遗传转化实验中,潮霉 素和庆大霉素常被用作抗性选择压的筛选。头孢霉素 和羧苄霉素常被用作抑制农杆菌过度生长的抑菌剂。 由于不同种类抗生素在转化实验中所起到的作用不 同,不同浓度抗生素对农杆菌的抑制效果不同,不同种 类植物和外植体对抗生素的敏感反应也存在差异。在 培养基中添加抗生素后,抗生素对植物的分化和生长 发育有一定的影响[3],因此,通过筛选试验确定出最佳 的抗生素使用范围和临界值,对从事遗传转化研究有 重大的意义[4-5]。潮霉素、庆大霉素、羧苄霉素、头孢霉素 作为常用的抗性筛选标记基因和抑菌剂被广泛用于植 物的遗传转化工作。由于芍药不同外植体的生长状态 和分化能力间存在差异,不同形态的外植体对不同抗 生素的反应不同,所以在转化之前需对以上几种抗生 素的使用浓度进行探讨。

  3.2 抗生素不同种类和浓度对不定芽分化的影响

  适合的抗生素浓度是在不影响细胞正常生长的前 提下,有效抑制非转化细胞的生长[6]。在转基因实验中, 通常导入的目的基因会对抗生素产生抗性,从而进一 步筛选转化植株和非转化植株,并将非转化植株数量 控制在最小范围内。本试验表明,潮霉素和庆大霉素对 子叶和愈伤组织的分化均具有抑制作用,潮霉素的抑 制作用更加显著,更适宜作为选择剂使用。潮霉素对不 同外植体的分化作用也不尽相同,在同一浓度潮霉素 下,子叶的不定芽分化率更高。所以选子叶作为外植体遗传转化受体更佳。 当植物材料经农杆菌浸染后,需及时用抗生素有 效杀死并抑制农杆菌生长,以防危害外植体的生长和 分化,其中杀菌和抑菌效果最好的是头孢霉素(Cef)和 羧苄霉素(Carb)。然而抗生素对各种植物的组织分化 影响不一[7-9]。因此,要测试植物对不同种类抗生素的 敏感性,以确定抗生素筛选的临界浓度,并选择抑菌 效果好、对植物组织再生影响较小的抗生素进行除 菌,这是农杆菌介导的遗传转化成功的关键之一。

  本试验通过对芍药愈伤组织和子叶 2 种外植体 在不同种类及浓度的抗生素中不定芽再生效率的研 究,筛选了不同外植体各自的最佳抗生素和脱菌抗生 素的质量浓度。结果表明,芍药愈伤组织和子叶对抗 生素敏感,都可作为遗传转化的良好受体。以子叶和 愈伤组织 2 种不同的受体分别建立了较为完整的芍 药遗传转化受体系统,为进一步进行芍药分子生物学 转基因方面的研究奠定了基础,同时为芍药基因克 隆、分子鉴定等研究提供理论依据。

  参考文献:

  [1]任永霞,王罡,季静,等.根癌农杆菌介导的番茄遗传转化[J].河北北 方学院学报,2005,21(5):35-38.

  [2]任永霞,季静,王罡,等.植物遗传转化方法概述[J].河北北方学院学 报,2005,21(6):38-42.

  [3]Lin J J,Nacyra A G,Jonathan K.Plant hormone effect of antibiotics on transformation efficient of Plant tissue by Agrobacterium tumefaciens cells[J].Plant Sci,1995,109:171-177.

  [4]张明洲,崔海瑞,舒庆尧,等.抗生素对高粱愈伤组织诱导和生长的 影响[J].浙江大学学报,2004,30(2):221-222.

  [5]梁美霞,许向阳,李景.抗生素对番茄愈伤组织诱导和分化的影响 [J].东北农业大学学报,2005,36(1):19-22.

  [6]唐东芹,钱虹妹.百合基因转化直接分化受体系统的建立[J].江苏农 业科学,2003,(3):48-50.

  作者:程 婉,康 静


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